通过无菌渥堆处理与传统渥堆相比较，发现传统渥堆中存在相当数量的微生物，这些微生物是鲜叶经高温杀青，在以后的揉捻、渥堆中产生，并随渥堆繁殖。细菌（以无芽孢细菌占优势，少量芽孢细菌和球菌）从渥堆开始至30小时前后，其数量呈迅速增加趋势并达到高峰期，后期下降，真菌（假丝酵母菌属占优势，其次为黑曲霉，少量青霉及芽枝霉等）则不同，其数量随渥堆时间的延长一直处于增加状态，只是到末期才略有下降。在渥堆中所闻到的甜酒味就是酵母菌作用的结果。
微生物酶学研究证实：黑曲霉是分泌胞外酶极为丰富的菌种，不仅可以分泌纤维素酶，果胶酶，蛋白酶，脂肪酶和多种糖化酶等水解裂解酶，还可以分泌多酚氧化酶类，渥堆中出现的大量酵母菌以及细菌都有分泌多种胞外酶的能力。而且，鲜叶经高温杀青，使酶蛋白大都变性而失活，所以在渥堆过程中，酶不会“复活”。
在研究黑茶渥堆过程中酶活性变化时，采用无菌处理证实了这一点。同时，研究表明过氧化物酶有较强的热稳定性，杀青后有相当一部分残余活性存在，但在渥堆24小时后活性就逐渐消失，因此靠过氧化物酶来催化茶叶内含物氧化十分有限，但多酚氧化酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶及其同工酶的活性在渥堆12小时后有明显的增加，与同期的微生物数量变化一致，且平行实验（无菌渥堆处理）酶活性无此变化。因此，这些酶是微生物代谢过程中分泌的胞外酶。正是由于微生物在渥堆工序中种群的更迭和数量的消长决定了渥堆过程中酶体系的种类与活性水平，为渥堆变化提供了生化动力。
同时，由于微生物的大量繁殖，其呼吸代谢释放热量导致渥堆叶温度不断升高，关联度分析结果表明，温度与微生物总数量间的关联度达到了0.9956。叶温的升高，一方面，加快了微生物酶促反应的速率，为其提供了物化动力——微生物热；另一方面，随着微生物呼吸作用的进一步加强，导致渥堆叶内的水分相应增加（这时从感官上可发现，渥堆叶表面有较强的黏手感，甚至有泥滑现象），从而进一步加大了湿热作用的强度。用无菌渥堆处理与传统渥堆处理对比，其工序的湿热作用强度与常规基本相同，发现前者品质虽表现出无粗青气味，汤色黄亮，但缺乏黑毛茶特征性的品质风味，这一方面说明渥堆过程中湿热作用发生的理化变化，为黑毛茶品质形成打下了一定基础：另一方面也说明常规渥堆与无菌渥堆期间，物质转化动力上的差异是决定品质风味的关键。前者使微生物及其胞外酶的生化动力作用于堆温不断升高的渥堆叶内的各种相应底物，如蛋白质、果胶、纤维素、儿茶素以及各种香气物质，使之发生剧烈的酶促反应，使整个渥堆体系的物质代谢的速度和方向有别于无菌渥堆的纯热物理化学作用。此外，还有微生物代谢释放的有机酸及其各种代谢产物，它们一起形成了黑毛茶特有的品质风味，从而使之有别于红茶的“发酵”和黄茶的“闷黄”。这是无菌渥堆条件所不具有的。
微生物专家温琼英教授对黑茶渥堆过程中的微生物进行分离纯化培养，结果表明：参与黑茶渥堆过程的微生物包括假丝酵母菌、黑曲霉菌、细菌等。这些微生物在茶堆中，只要温、湿度适宜，就能大量繁衍，利用茶叶中的碳、氮化合物作为培养基，不断生长发育繁衍后代。一方面，通过微生物的胞外酶分解茶叶中的大分子化合物，作为自身机体的构成部分；另一方面，排泄（或称分泌）一些小分子化合物。一吸一吐，使茶叶的内含成分发生巨大的改变，从而形成黑茶特有的品质特征。
色泽方面：茶多酚在胞外酶作用下氧化聚合形成茶黄素、茶红素、茶褐素，残余叶绿素的降解，类胡萝卜素及其降解产物，儿茶素氧化产物与未氧化的黄酮类及氨基酸和糖类的综合产物综合作用，形成了黑茶黄褐的外形和叶底、橙黄的汤色等品质特征。
香气方面：形成了以萜烯醇类和芬环醇类，醛酮类为主体的香气组分比。据实验：黑茶香气组分中有11种不同于绿茶的香气成分。
滋味方面：茶多酚、氨基酸、可溶性糖下降，尤其是酯型儿茶素含量下降，从而使苦涩、浓烈的滋味成分减少。醇和型滋味物质增加，使黑毛茶滋味趋于醇和，而且在微生物胞内酶系统作用下，合成了含量较低但对人体有益的许多种必需氨基酸。如酵母菌在代谢过程中可以合成赖氨酸，而其本身又不能利用赖氨酸。这对改善黑茶品质十分有利而且又提高了它的营养价值。此外，还发现纤维素酶、蛋白酶的活性都有一定程度的增加，能在一定程度上分解纤维素和蛋白质，形成水溶性滋味物质，这对改善黑毛茶的粗老味，增进茶汤厚度有十分重要的意义。
